Methoden und Analytik zum liposomalen Einschluss von D29-Mykobakteriophagen zur Tuberkulo-setherapie

Ziel dieser Arbeit war es, Mykobakteriophagen in ein liposomales Trägersystem einzuschließen. Mykobakteriophagen sind wirtsspezifische Viren, die einen bestimmten Bakterienstamm infizieren und sich dort replizieren, in diesem Fall Mykobakterium tuberculosis. Diese Bakterien verursachen in den meisten Fällen Tuberkulose (TB). In dieser Arbeit wurden D29-Mykobakteriophagen als Modellviren eingesetzt. Diese für den Menschen apathogenen Viren infizieren und bekämpfen Mykobakterien durch Lysotypie. Makrophagen dienen dabei als Wirt für die Mykobakterien. Damit Mykobakteriophagen effektiv arbeiten können, müssen sie das Phagosom der Makrophagen unbeschadet erreichen. Es ist wichtig, das menschliche Immunsystem zu umgehen, andernfalls werden Antikörper gegen die viralen Strukturen der Phagen gebildet. Aus diesem Grund sollte ein liposomales Trägersystem zur innovativen Behandlung der TB entwickelt werden. Es sollten Methoden zum liposomalen Einschluss größerer Strukturen (in dieser Arbeit D29 Mykobakteriophagen) entwickelt werden, die zu einer hohen Einschlusseffizienz bzw. Einschlusskapazität führen. Faktoren, die die Einschlusseffizienz beeinflussen, begründen sich durch folgende Parameter: dem inneren Volumen der Liposomen, der Lipidzusammensetzung, der angestrebten Vesikelgröße sowie Größe und Konzentration des zu verkapselnden Materials. Im vorliegenden Fall stellte die Größe der D29-Mykobakteriophagen eine Herausforderung dar, da diese mit über 200 nm im Größenbereich üblicher stabiler liposomaler Vesikel liegt. Verschiedene Herstellungsmethoden wurden auf ihre Eignung zum effizienten Einschluss von Mykobakteriophagen überprüft: so z. B. Elektroformation, Ethanolinjektion und Duale Asymmetrische Zentrifugation (DAC). Einen weiteren Schwerpunkt dieser Arbeit bildete die Etablierung einer geeigneten Analytik zum Nachweis des Einschlusses von D29-Mykobakteriophagen vornehmlich mit Hilfe der Dichtegradientenzentrifugation und fluoreszenz-mikroskopischer Analysemethoden. Die gleichzeitige Fluoreszenzmarkierung von Liposomen, viraler DNA und des Phagenkapsids sollten den Einschluss bzw. die Assoziation von Mykobakteriophagen in Liposomen belegen. Die Auswertung stützte sich dabei auf Cyro-Transemissionselektronenmikroskopie (Cryo-TEM), konfokale Laser Scanning Mikroskopie (CLSM), Durchflusszytometrie und mikrobiologische Untersuchungsmethoden, wie Plaque- und Infektions-Assays.