Mit dem Blotter DNA-Abdrücke auf Membranen übertragen
In der
Molekularbiologie wird viel geforscht, so auch mittels
Elektrophorese mit DNA, RNA, Proteinen und vielem mehr. Zweck ist es, die Erbanlagen zu identifizieren, neues Erbgut wie für gentechnisch veränderte Pflanzen zu schaffen oder Krankheitsauslöser zu erkennen. DNA wird in einer
Blotkammer auf einer Gelplatte mit Strom in zwei Stränge aufgeteilt und einzelne Strangstücke selektiert. Um ein dauerhaftes Ergebnis zu erhalten, wird zuerst das Abbild im Gel auf eine Membran im Wege des Blottings übertragen. Der Vorgang des Southern Blot beschäftigt sich dabei mit DNA, während das Prinzip des Northern Blot RNA betrifft. Western Blot steht für die Übertragung von Proteinen. Nach dem Blotting werden die Moleküle, die jetzt an der Membran kleben, im Crosslinking-Verfahren -oft mit UV-Licht -dauerhaft fixiert. Anschließend steht die Membran zur Hybridisierung bereit: man kann also andere DNA, RNA oder Proteine mit denen auf der Membran verbinden.
Die unterschiedlichen Blottingverfahren
Im Wesentlichen kann man drei verschiedene Blottingverfahren unterscheiden:
- den Kapillar-Blot,
- den Vakuum-Blot und
- den Elektro-Blot.
Der Kapillar-Blot
Hier wird das Gel auf einer Plastikfolie abgesetzt, die Membran darüber gelegt, dann Filterpapier und zuletzt Papierhandtücher als Saugmaterial oben auf gestapelt. Zuletzt wird der Stapel mit einer Glasplatte abgedeckt und von oben beschwert. Die Moleküle wandern aufgrund Kapillardrucks oder schlicht Diffusion in die Membran.
Die Vakuum- und Pressure-Blotter
Man legt die Gelplatte in den Blotter, die Membran darüber und füllt die Transferlösung ein. Der Vakuum-Blotter zieht den Transferpuffer durch Gel und Membran, während der Druck-Blotter ihn hindurch drückt. Dadurch soll das Blottingverfahren anstatt eine Nacht nur eine Stunde dauern, was natürlich sehr effizient ist. Der Nachteil bei diesen Geräten ist, dass die Gelmaske verloren gehen kann.
Elektro-Blotter
Manche Gele erlauben kein Lösen der Moleküle im Rahmen des Kapillartransfers. Ein Beispiel hierfür sind Polyacrylamidgele. Für diese verwendet man am besten Semi-Dry-Blotting-Apparaturen. Der Aufbau sieht dem der Kapillar-Blotter ähnlich, wobei sich unter dem Stapel eine rechteckige Elektrode befindet und über dem Stapel eine entsprechende Anode. Verschliesst man den Blotter, drücken die Elektroden den Stapel zusammen. Die Moleküle wandern hier aufgrund elektrischer Anziehung.
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